Lokalizacija molekularnih tarč v tkivnih rezinah

Imunolokalizacija

Lokalizacija antigenov v tkivih ali celicah s pomočjo specifične vezave označenih protiteles. Večinoma uporabna za lokalizacijo proteinov, poleg tega tudi za lokalizacijo drugih bioloških molekul (polisaharidi, glikoproteini, hormoni in drugo), ki lahko sprožijo imunski odziv (pomembno za pripravo specifičnih protiteles).

Shema imunolokalizacije

Shema imunolokalizacije (vir: Wikimedia commons)

Literatura:

Za optimizacijo imunolokalizacije je pomembno:

  • fiksacija tkiva (navadno 3,7% paraformaldehid v pufru, rastline v FAA)
  • vklapljanje v vosek (Paraplast Plus), ali zmrznjene rezine
  • postopek "antigen retrieval", več možnih načinov
  • blokiranje nespecifičnih vezavnih mest za protitelesa (lahko le z BSA, lahko polega tega tudi z neimunim serumom iz enake vrste kot so sekundarna protitelesa)
  • izbira vrste primarnih protiteles (za parafinske rezine primernejša poliklonska protitelesa, ker so nekateri epitopi morda nedostopni; za zmrznjene rezine pa lahko uporabimo monoklonska protitelesa, ki so bolj specifična)
  • optimizacija koncentracije primarnih protiteles (zelo pomembno, optimalna koncentracija je lahko v rangu od 1:10 do 1:1.000.000)
  • čas in temperatura inkubacije s primarnimi protitelesi (navadno čez noč na 4°C)
  • inkubacija s sekundarnimi zahteva dosti manj optimizacije, navadno po navodilih proizvajalca (koncentracija navadno 1:1000, inkubacija 1 h na sobni temperaturi)
  • inkubacija s substratom po navodilih proizvajalca.

Imunolokalizacija encima sintaze saharoze v koreninski čepici koruze

Imunolokalizacija encima sintaze saharoze v koreninski čepici koruze. Primarna protitelesa proti sintazi saharoze so neoznačena. Zaznamo jih s sekundarnimi protitelesi, ki so označena z zlatimi delci, na katere se naloži srebrov precipitat (temno obarvanje).

Metoda je uporabljena v članku: Kladnik A, Vilhar B, Chourey PS, Dermastia M (2004) Sucrose synthase isozyme SUS1 in the maize root cap is preferentially localized in the endopolyploid outer cells. Canadian Journal of Botany 82: 96-103.

Hibridizacija in situ

Lokalizacija specifičnih zaporedij nukleinskih kislin v bioloških preparatih s pomočjo vezave sonde na tarčno zaporedje v tkivu. Sonda je krajša označena molekula nukleinskih kislin s komplementarnim zaporedjem kot iskana nukleinska kislina v preparatu, zato se ob ustreznih pogojih vezave stabilno vežeta (hibridizacija).

Literatura:

Optimizacija in situ hibridizacije:

  • vrsta sonde (RNA sonda, oligonukleotidi, DNA sonda, druge oblike kot so LNA, PNA)
  • dolžina sonde (RNA sonde okoli 300 baz, oligonukleotidi okoli 32 baz)
  • Tm - melting temperatura (% GC, dolžina)
  • porazdelitev GC, tvorba zank (mFold), tvorba dimerov (preverjanje s programom za dizajn primerjev, kot je npr. primer3)
  • dostopnost tarčnega zaporedja (težava za oligo sonde, nekateri deli tarče bolj zviti kot drugi, zato dizajnirati več sond na različnih delih gena)
  • acetilacija
  • permeabilizacija tkiva (inkubacija s proteinazo - proteinase K, pronase E)
  • hibridizacijska mešanica (koncentracija sonde, koncentracija Na+ ionov, pH, pomožne snovi za povečevanje efektivne koncentracije sonde, formamid)
  • detekcija (fluorescenčna - za sonde direktno označene s fluorokromi, posredna - imunološka detekcija sonde z označenimi protitelesi)

Hibridizacija in situ z RNA sondami (teosinte, koruza)

Hibridizacija in situ z RNA sondami (A, B - teosinte, C, D - koruza). Lokalizacija mRNA za encim INCW2 v zrnu teozinta (A) in koruze (C). A in C prikazujeta hibridizacijo s protismiselno sondo (komplementarno mRNA v tkivu, zato se vežeta), B in D pa je kontrola s smiselno sondo (enako zaporedje kot mRNA v tkivu). Sonde so označene z digoksigeninom, ki ga detektiramo z Anti-DIG protitelesi konjugiranimi z alkalno fosfatazo (Roche), substrat je NBT/BCIP (Roche).

Metoda je uporabljena v članku: Dermastia M, Kladnik A, Dolenc Koce J, Chourey PS (2009) A cellular study of teosinte Zea mays subsp. parviglumis showing several processes conserved in maize. American Journal of Botany 96: 1789-1807.

Hibridizacija in situ z oligonukleotidnimi sondami (lan)

Hibridizacija in situ z oligonukleotidnimi sondami. Lokalizacija mRNA za protein LIN1 v stebelnem vršičku kalic lanu, prikazana je indukcija ekspresije LIN1 z etilenom. Zgornja vrsta prikazuje hibridizacijo s protismiselno sondo (anti-sense), sonda je dolga 30 nukleotidov, označena z digoksigeninom.

Metoda je uporabljena v članku: Anžlovar S, Gruden K, Rogelj B, Štrukelj B, Dermastia M (2006) Molecular characterization of the linusitin-like gene family from flax. International Journal of Plant Science 167(2): 231-238.

TUNEL

Lokalizacija jeder s poškodovano DNA v tkivnih rezinah s pomočjo označenih nukleotidov, ki se vežejo na proste 3' OH konce DNA. V procesu programirane celične smrti apoptotskega tipa specifične endonukleaze razrežejo jedrno DNA na manjše fragmente, tako je z napredovanje procesa v jedru vedno več DNA s prostimi 3' OH konci.

TUNEL princip

TUNEL, embrio koruze TUNEL, embrio koruze, DAPI

TUNEL barvanje v endospermu koruze, kjer rastoči embrio razgrajuje endosperm (levo TUNEL - pobarvana jedra s poškodovano DNA, desno DAPI - pobarvana vsa jedra)

TUNEL, teosinte

TUNEL v zrnu teozinta (prednik koruze), celice nucela propadajo ob začetku rasti endosperma (levo TUNEL, desno DAPI).

Metoda je uporabljena v članku: Kladnik A, Chamusco K, Dermastia M, Chourey P (2004) Evidence of Programmed Cell Death in Post-Phloem Transport Cells of the Maternal Pedicel Tissue in Developing Caryopsis of Maize. Plant Physiology 136: 3572-3581.

TUNEL+DAPI, koruza

Skupna slika barvanja TUNEL in DAPI (zeleno TUNEL - jedra s fragmentirano DNA, modro DAPI)